El primer cuadro se desarrolla frente al palacio ducal, en el carnaval. El pueblo se divierte. Barnaba ve acercarse a la Gioconda con su madre. Desea a la joven y bella cantante callejera, pero ésta ama al príncipe Enzo Grimaldo, que por razones políticas está desterrado. Cuando la Gioconda lo rechaza de nuevo, Barnaba decide alcanzar su objetivo por medio de la presión. Acusa de brujería a la anciana ciega, madre de Gioconda. A causa de sus hechizos, Zuane ha perdido la regata.
El barquero subleva al pueblo contra la ciega. Enzo, que ha regresado en secreto y está disfrazado de marinero dálmata, intenta inútilmente protegerla. Entonces se abren las puertas del palacio ducal, Badoero aparece al lado de su esposa Laura. Barnaba acusa a la ciega, y el inquisidor decide, presionado por el pueblo, llevarla ante el juez. Desesperada, la Gioconda trata de cambiar su decisión, pero sólo la intervención de Laura lo ablanda. La anciana ciega le regala un rosario y canta el aria, que se ha hecho célebre, «Voce di donna o d'angelo». Laura ha reconocido a Enzo entre la multitud y vuelve a encenderse el antiguo amor de ambos. Barnaba los ha observado y se acerca a Enzo ofreciéndose a llevarle a Laura aquella misma noche a su barco. Enzo acepta, a pesar de sus dudas. La Gioconda descubre el doble juego de Barnaba y decide salvar a su amado.
El acto segundo se desarrolla a orillas del mar: gran escena musical con coros, en parte a ritmo de barcarola; en el punto culminante está la magnífica aria de Enzo «Cielo e mar!», la pieza de exhibición de todos los tenores del bel canto. Laura llega en un bote para huir con su amado y comenzar lejos de Venecia una vida más feliz. Enzo da las órdenes para partir. Entonces aparece la Gioconda; su primer impulso consiste en matar a la rival, pero Laura le enseña el rosario que le dio la madre ciega como agradecimiento por haberla salvado de las turbas. La Gioconda salva a Laura en su propio bote de los esbirros de Barnaba, que se aproximan. Enzo libra una lucha desesperada contra la fuerza superior de los barcos enemigos; al verse perdido, incendia su barco.
En el acto tercero, Badoero ha jurado que matará a su infiel esposa. Barnaba lo ha revelado todo. Han perseguido y encarcelado a Laura, que debe beber una copa de veneno que le ha dado su esposo. Sin embargo, la Gioconda, que se encuentra en palacio, ha logrado reemplazar el veneno por un narcótico, que Laura bebe en ese momento. Mientras en las salas de palacio se celebra una fiesta deslumbrante, para la que Ponchielli compuso la inspirada «Danza de las horas», una música de ballet conocida en todo el mundo, Badoero contempla el supuesto cadáver de su esposa. Luego anuncia su suicidio a los invitados. Lanzando un grito, uno de los invitados se quita la máscara y se enfrenta al inquisidor con actitud amenazante: es Enzo. Los guardias lo reducen rápidamente. La Gioconda promete a Barnaba que le pertenecerá si salva a Enzo. Para poder ejercer una doble presión sobre la cantante, Barnaba secuestra a la madre ciega.
El último cuadro se desarrolla en la casa de la Gioconda. Personas de confianza introducen a Laura, sumida en un profundo sueño. Enzo ha sido liberado por Barnaba, pero cree que Laura está muerta. La Gioconda ha tomado una decisión: quiere unir a Laura y a Enzo, que deben huir al extranjero. Luego, para no pertenecer a Barnaba, quiere suicidarse. Laura despierta y con Enzo se arrodilla frente a la Gioconda, a quien ambos amantes deben tanto. Cuando huyen de allí, comienza el trágico final. La cantante dice a Barnaba, que irrumpe en la habitación, que quiere adornarse para él. De ese modo puede coger la daga sin ser descubierta y clavársela en el corazón. El delator, lleno de odio, le arroja a la cara la noticia de que ha estrangulado a su madre, pero la Gioconda ya no lo oye.
